为探讨 FAM3D 与动脉粥样硬化发生之间的潜在关联，研究人员首先获取了一个可公开访问的综合性蛋白质组-表型资源库。其中包括一项针对英国生物银行(the UK Biobank)中 53,026 名成年人(中位随访时间：14.8 年)的血浆蛋白质组详细图谱，该图谱展示了 2,920 种蛋白质的循环水平与 406 种已发疾病及 660 种新发疾病之间的关联。研究人员分别采用逻辑回归模型和 Cox 比例风险回归模型进行了分析。在众多血浆蛋白中，研究人员特别注意到，循环中的 FAM3D 不仅与冠状动脉粥样硬化患病率存在显著的蛋白-疾病关联，还与新发冠状动脉粥样硬化的风险密切相关。(图 1 A)。

fig.1

为进一步验证公共数据库中循环 FAM3D 与动脉粥样硬化发病率之间的相关性，研究人员对一组前瞻性队列研究对象开展了一项巢式病例对照研究，这些受试者自 2012 年至 2018 年进行了约 6 年的随访(图 1 B)。研究人员采用多因素条件 Logistic 回归分析，并对潜在混杂因素，包括高密度脂蛋白(HDL)和估算肾小球滤过率进行了校正。通过连续测定血浆 FAM3D 水平，计算了优势比(ORs)。总体而言，基线血浆 FAM3D 水平的升高与 6 年随访后颈动脉内膜中层厚度(cIMT)增厚风险的增加呈显著相关。每升高 3.45 ng/mL 血浆 FAM3D 水平(即一个标准差)，发生 cIMT 增厚的 OR 值为 1.27(图 1 C)。据此，研究人员建立了基线血浆 FAM3D 水平与未来 cIMT 增厚发病率之间的预测概率曲线，提示血浆 FAM3D 水平升高具有预测早期动脉粥样硬化病变发生的潜力(图 1 D)。

为探讨 FAM3D 在动脉粥样硬化中的作用，研究人员建立了一种小鼠动脉粥样硬化模型。将 8 周龄的 Fam3d−/− 雄性和雌性小鼠及其同窝野生型(WT)小鼠通过尾静脉注射腺相关病毒 AAV8-PCSK9D377Y 以诱导肝细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)降解。随后，这些小鼠接受为期 12 周的高脂饮食(HFD)，以诱导高脂血症和动脉粥样硬化。与人类相似，与对照组相比 HFD 喂养的动脉粥样硬化小鼠血浆中 FAM3D 水平显著升高。无论是雄性还是雌性 Fam3d−/− 小鼠，其血浆总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平均较同性别 WT 小鼠明显降低。进一步采用快速蛋白质液相色谱(FPLC)分析血浆脂质谱发现，与同窝 WT 小鼠相比 Fam3d−/− 小鼠的极低密度脂蛋白/乳糜微粒(VLDL/CM)和低密度脂蛋白(LDL)组分中的血浆 TC 和 TG 水平显著降低。由于 VLDL/CM 和 LDL 脂蛋白在动脉粥样硬化发生中起重要作用，因此 FAM3D 缺乏可显著减轻雄性和雌性小鼠动脉粥样硬化的发生，这一点可通过主动脉外膜油红 O 染色证实。此外，对主动脉根部横截面进行斑块成分分析发现，与 WT 小鼠相比 Fam3d−/− 小鼠斑块中的主要成分——包括脂质沉积、平滑肌细胞以及巨噬细胞——均明显减少。鉴于研究人员所采用的 HFD 方案(脂肪占总热量的 40% 胆固醇含量为 1.25%)也能有效诱导脂肪肝或肝脂肪变性，研究人员还评估了 FAM3D 缺乏是否会影响肝脏的脂质蓄积。肝组织油红 O 染色结果显示 FAM3D 缺乏并未改变 HFD 诱导的肝脂质蓄积程度，从而排除了 FAM3D 对脂肪肝或肝脂肪变性发病机制的影响。因此 FAM3D 缺乏能够显著降低血液脂质水平并抑制动脉粥样硬化进展，同时并不影响肝脂肪变性。

接下来，研究人员确定了 FAM3D 的组织来源，该蛋白主要调节血脂水平和动脉粥样硬化。研究人员让 8 周龄的雄性 Ldlr−/− 小鼠连续两周饲喂高脂饮食(HFD)。随后，研究人员在与动脉粥样硬化相关的组织和细胞类型中检测了 FAM3D 的表达水平，包括直接参与斑块形成的主动脉和白细胞，以及参与血脂水平调控的肝脏和肠上皮细胞。此外，研究人员还评估了 FAM3D 在肾脏和肺部的潜在调控作用。结果显示，在 Ldlr−/− 小鼠饲喂 HFD 后，主动脉和肠上皮细胞中的 FAM3D 表达显著上调，而在肝脏、肾脏、肺以及白细胞中则未观察到明显的 FAM3D 表达。这些发现提示，源自主动脉和肠上皮细胞的 FAM3D 可能对动脉粥样硬化的发展具有重要贡献。考虑到肠道而非主动脉在脂质代谢中发挥着关键作用，尤其是在介导脂质吸收及随后乳糜微粒生成方面，研究人员进一步探究了肠上皮细胞来源的 FAM3D 是否会影响血液脂质水平以及动脉粥样硬化的进展。

据此，研究人员通过杂交 Fam3df/f 小鼠与 Vil1-Cre 小鼠，生成了肠上皮细胞特异性 FAM3D 敲除(Fam3diko)小鼠。同窝出生的 Fam3df/f 小鼠用作野生型对照。8 周龄的雄性 Fam3diko 小鼠和 Fam3df/f 小鼠分别接受 AAV8-PCSK9D377Y 病毒注射，并饲喂高脂饮食 12 周(图 2 A)。与野生型对照相比 Fam3diko 小鼠血浆中 FAM3D 水平以及血液中的总胆固醇和甘油三酯水平显著降低，尤其在极低密度脂蛋白/乳糜微粒和低密度脂蛋白组分中尤为明显(图 2 B-E)。此外，肠上皮细胞中 FAM3D 的缺失抑制了动脉粥样硬化的进展(图 2 F and G)，这表明来自肠上皮细胞的 FAM3D 对高脂血症及其后续的动脉粥样硬化发生具有重要贡献。

fig.2

由于小肠是脂质吸收的主要器官，研究人员评估了肠上皮 FAM3D 是否会影响动脉粥样硬化小鼠的脂质吸收。在高脂饮食喂养 12 周后，感染 AAV8-PCSK9D377Y 的 Fam3diko 与 Fam3df/f 小鼠之间的总食物摄入量和粪便排泄量相当。然而，肠上皮细胞中 FAM3D 的缺失显著增加了粪便中胆固醇和游离脂肪酸(FFA)的含量，提示粪便中胆固醇和甘油三酯的排泄增加(图 2 H)。为了直接比较各组间肠道对甘油三酯的吸收情况，研究人员进行了口服脂肪耐受试验(OFTT)。结果显示，与 Fam3df/f 小鼠相比 Fam3diko 小鼠在灌胃油脂后血浆甘油三酯水平更低(图 2 I)。在动脉粥样硬化诱导过程中 Fam3d−/− 小鼠与同窝野生型小鼠相比也表现出类似的结果，这进一步证实了 FAM3D 在小鼠体内介导了肠道对胆固醇和甘油三酯的吸收。

为阐明 FAM3D 介导肠道脂质吸收的分子机制，研究人员检测了 FAM3D 是否调控与脂质吸收相关的基因表达(图 3 A)。在这些基因中，与野生型上皮细胞相比 FAM3D 缺陷的空肠上皮细胞中 ACAT2 和 MTTP 的表达显著下调(图 3 B)。有趣的是，胆固醇转运蛋白 NPC1L1 的表达则因 FAM3D 缺陷而显著上调，提示肠道上皮细胞内胆固醇的转运增加。考虑到 Fam3diko 小鼠肠道胆固醇吸收受到抑制，因此 NPC1L1 的上调可能是一种代偿性反馈机制，以应对脂质吸收减少。接下来，研究人员进一步验证了 FAM3D 对 MTTP 和 ACAT2 蛋白表达的影响。Western blot 结果显示 FAM3D 缺陷显著降低了 MTTP 蛋白的表达，但对 ACAT2 蛋白的表达仅产生轻微抑制(图 3 C)。相反，研究人员在肠道上皮细胞系 Caco-2 细胞中通过腺病毒介导过表达 FAM3D (Ad-FAM3D) 模拟动脉粥样硬化小鼠肠道上皮细胞中 FAM3D 表达的病理性升高。结果表明 FAM3D 过表达显著上调了 MTTP 蛋白的表达，而对 ACAT2 的表达无明显影响(图 3 D)。综合以上结果，研究人员推测 FAM3D 主要通过调控 MTTP 的表达来影响肠道上皮细胞的功能。随后，研究人员评估了 MTTP 在将甘油三酯和胆固醇酯等中性脂质转运至新生 apoB 以组装乳糜微粒(CM)过程中的活性。FAM3D 缺陷导致 MTTP 表达下调，从而抑制其脂质转运活性；而 FAM3D 过表达则通过上调 MTTP 的表达，增强了其脂质转运活性(图 3 E and F)。这些结果提示 FAM3D 通过上调 MTTP 的表达，进而增强其组装 CM 的能力，这或许可以解释 FAM3D 在调节血浆总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平中的作用，尤其是在极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)组分中的作用。由于 MTTP 在肝脏中也高度表达，参与肝源性 VLDL 的生成，研究人员还检测了 Fam3d−/− 和 Fam3diko 小鼠肝脏中 MTTP 的表达情况。值得注意的是，全身或肠道上皮细胞特异性 FAM3D 缺陷均未影响肝脏中 MTTP 的表达，这表明 FAM3D 主要参与肠道中 CM 的组装与生成，而非肝脏中 VLDL 的合成。

fig.3

鉴于 FAM3D 是一种分泌型细胞因子样蛋白，研究人员使用纯化的 FAM3D 蛋白来检测 FAM3D 是否在细胞外发挥其功能。外源性 FAM3D 蛋白持续上调了 MTTP 的蛋白表达，而对 ACAT2 蛋白则无影响。因此，研究人员假设上皮细胞中的 FAM3D 以自分泌方式上调 MTTP 的表达。

FPR1 和 FPR2 均在肠上皮细胞中表达。接下来，研究人员探究了这两种已鉴定的 FAM3D 受体是否介导了 FAM3D 对 MTTP 表达以及 MTTP 介导的中性脂质向 apoB 转移以形成乳糜微粒的作用。研究人员用 FPR1 拮抗剂 cyclosporin H (CsH) 或 FPR2 拮抗剂 WRWWWW-NH2 (WRW4) 处理 Caco-2 细胞。结果表明，只有 CsH 能有效抑制 FAM3D 促进的 MTTP 表达及 MTTP 介导的中性脂质向 apoB 的转移(图 3 G-H)。同时，特异性敲低 FPR1 而非 FPR2 也能抑制 FAM3D 上调的 MTTP 表达。这些数据共同表明 FPR1 而非 FPR2 介导了 FAM3D 对肠上皮细胞中 MTTP 表达及其活性的影响。为进一步探索如何调控 MTTP 表达，研究人员检测了调控 MTTP 表达的转录激活因子和抑制因子基因是否受到 FAM3D 的调节。结果显示 FAM3D 仅特异性上调了转录激活因子 HNF4α 的表达。同时 FAM3D 缺失显著抑制了高脂饮食诱导的小鼠肠上皮细胞中 HNF4α 的表达。这些结果共同提示 FAM3D 通过 HNF4α 介导的转录通路上调了 MTTP 的表达。

综上所述，肠上皮中的 FAM3D 通过自分泌方式上调 MTTP 的表达，进而增强 MTTP 介导的 CM 组装，这一过程依赖于细胞表面受体 FPR1 的作用。这种机制有助于促进肠道对脂质的吸收，从而进一步加剧高脂血症和动脉粥样硬化的发展。

有趣的是，研究人员观察到，在高脂饮食喂养后 Ldlr−/− 小鼠的主动脉 FAM3D 表达上调。研究人员先前的研究表明，主动脉 FAM3D 主要定位于内皮细胞(ECs)，而非血管平滑肌细胞(VSMCs)；而内皮 FAM3D 的表达会因易致动脉粥样硬化的作用因素——如促炎性细胞因子和血流紊乱——而显著上调。因此，研究人员探究了内皮 FAM3D 是否参与了动脉粥样硬化的发生与发展。为实现内皮细胞特异性敲低 FAM3D 研究人员对 8 周龄的雄性 Ldlr−/− 小鼠进行了尾静脉注射，分别给予携带 Tie2 启动子驱动的 shFam3d 的 AAV9 病毒(AAV9-Tie2-shFam3d)或对照病毒(AAV9-Tie2-shControl)，随后进行 12 周的高脂饮食喂养(图 4 A)。通过免疫荧光染色和定量 PCR(RT-qPCR) 验证了 Fam3d 在内皮细胞中的特异性敲低效率。考虑到 Tie2 在造血干细胞来源的白细胞中也具有活性，研究人员发现白细胞中并无明显的 FAM3D 表达，从而排除了 AAV 病毒感染可能介导的白细胞中 FAM3D 的沉默效应。内皮细胞特异性敲低 FAM3D 显著抑制了动脉粥样硬化斑块的形成，并减少了斑块中巨噬细胞和血管平滑肌细胞的含量(图 4 B and C)，但并未改变血浆中的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平。值得注意的是，内皮细胞特异性敲低 FAM3D 还降低了血浆中的 FAM3D 水平，尽管其降幅小于肠上皮细胞特异性敲除的效果。这些发现提示，内皮细胞来源的 FAM3D 通过一种不依赖于脂质的机制促进了动脉粥样硬化的进展。

fig.4

为进一步证实 FAM3D 在动脉粥样硬化中不依赖于脂质的作用，研究人员采用小鼠部分颈总动脉结扎模型。部分颈总动脉结扎可在非高脂血症条件下产生促动脉粥样硬化剪切应力，从而导致颈总动脉内膜增生，形成类似动脉粥样硬化的新生内膜。研究人员首先对 Fam3d−/− 小鼠实施部分颈总动脉结扎，发现 FAM3D 缺乏可减轻部分结扎诱导的内膜增生，提示 FAM3D 在与动脉粥样硬化相关的血管重塑中具有不依赖于脂质的作用。随后，研究人员对经部分颈总动脉结扎 1 周的野生型小鼠颈总动脉横断面进行了免疫荧光染色。值得注意的是，与未结扎对照组相比，部分结扎小鼠的内皮细胞中 FAM3D 表达显著上调，而血管平滑肌细胞中则无明显变化。此外，通过对颈总动脉内皮细胞进行整体免疫荧光染色及 RT-qPCR 检测，进一步证实了部分结扎小鼠内皮细胞中 FAM3D 表达较未结扎对照组显著升高。这些结果提示，内皮细胞中的 FAM3D 可能与部分结扎诱导的血管重塑存在潜在关联。据此，研究人员利用 AAV9-Tie2-shFam3d 载体敲低野生型小鼠内皮细胞中的 FAM3D, 随后对小鼠实施部分颈总动脉结扎，持续 4 周。结果显示，内皮细胞中 FAM3D 的沉默有效缓解了部分结扎诱导的小鼠颈总动脉新生内膜形成(图 4 D)。综上所述，这些数据表明，由内皮细胞产生的 FAM3D 以不依赖于脂质的方式驱动血管重塑，并加重动脉粥样硬化的进展。

部分颈动脉结扎模型涉及内皮细胞与血管平滑肌细胞之间的旁分泌相互作用。血管平滑肌细胞去分化在部分颈动脉结扎诱导的新生内膜形成和动脉粥样硬化过程中发挥着关键作用。因此，研究人员评估了 FAM3D 是否影响了血管平滑肌细胞的去分化。首先，研究人员使用纯化的 FAM3D 蛋白处理原代大鼠血管平滑肌细胞。结果表明，纯化的 FAM3D 蛋白显著下调了收缩表型标志物的表达，包括 α-actin, calponin, and SM22α, 这种下调在蛋白质水平和 mRNA 水平上均可见，提示血管平滑肌细胞的收缩表型发生了丧失。此外 FAM3D 蛋白以剂量依赖性方式促进了血管平滑肌细胞的增殖和迁移，这一点通过 CCK-8 实验和 Transwell 迁移实验得到了证实。进一步地，研究人员还证实，纯化的 FAM3D 蛋白可诱导人血管平滑肌细胞发生去分化，并促进其增殖和迁移(图 5 A-C)。

fig.5

接下来，研究人员研究了 FAM3D 如何诱导 VSMC 去分化。研究人员评估了 FPR1/2 是否介导了 FAM3D 对 VSMC 的作用。为此，研究人员分别使用 CsH 和 WRW4 来拮抗 VSMC 中的 FPR1 和 FPR2. 结果显示，与 WRW4 相比 CsH 能更有效地阻断 FAM3D 诱导的 VSMC 去分化，这一点通过 Western blotting, CCK-8 检测以及 Transwell 实验得到了证实。此外，在 VSMC 中敲低 FPR1 可逆转 FAM3D 诱导的 VSMC 去分化(图 5 D-F)，这表明 FPR1 在介导 FAM3D 诱导的 VSMC 去分化过程中发挥着关键作用。

作为经典的G 蛋白偶联受体(GPCR), FPR1 的下游信号涉及多种G 蛋白和β-arrestin 通路。为评估FAM3D 是否能激活FPR1 的下游信号，研究人员首先通过NanoBiT-G 蛋白解离分析和生物发光共振能量转移(BRET)分析，分别检测了HEK293T 细胞中G_αi, G_αq 和G_α13 的G 蛋白激活情况，以及β-arrestin 1/2 的招募情况。实验结果显示FPR1 的经典配体——fMLP 作为阳性对照，能够高效地激活上述所有G 蛋白及β-arrestin 通路。相比之下FAM3D 仅以剂量依赖性方式有限地促进了G_αi 和G_αq 与其相应G_βγ 的解离，这表现为生物发光信号的降低(图6 A and B)，但对G_α13 的解离并无显著影响(图6 C)，亦未见其对β-arrestin1/2 招募的明显作用(图6 D and E)。这些结果表明FAM3D 选择性地激活了G_αi/G_αq 信号通路。

fig.6

接下来，研究人员评估了 FPR1-G_αi/G_αq 信号是否介导了 FAM3D 在肠上皮细胞和 VSMC 中的作用(图 6 F)。首先，研究人员分别使用 PTX 和 YM254890 来抑制 Caco-2 细胞中 G_αi 和 G_αq 信号。结果表明，这两种抑制剂均显著抑制了 FAM3D 增强的 MTTP 表达与活性(图 6 G and H)，这表明 FAM3D 通过依赖于 FPR1-G_αi/G_αq 的信号，促进了肠上皮细胞中由 MTTP 介导的 CM 组装。随后，研究人员在 VSMC 中分别给予 PTX 和 YM254890. 通过 Western blot, CCK-8 检测以及 Transwell 实验，研究人员发现，阻断 G_αi 或G_αq 信号均可逆转 FAM3D 诱导的 VSMC 去分化(图 6 I-K)，提示 G_αi 和G_αq 信号均是 FPR1 下游的信号通路，参与了 FAM3D 诱导的 VSMC 去分化过程。综上所述，这些数据表明 FAM3D 通过 FPR1-G_αi/G_αq 信号，促进了肠上皮细胞中依赖于 MTTP 的 CM 组装以及 VSMC 的去分化。

鉴于研究人员已证实 FAM3D 可通过脂质依赖性和非脂质依赖性两种途径加重动脉粥样硬化进展，因此FAM3D 有望成为治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。研究人员利用杂交瘤技术筛选出两株对 FAM3D 具有较高亲和力的单克隆抗体(642 株的 KD值为 6.65 nM, 643 株的 KD 值为 3.69 nM)，可特异性识别纯化的 FAM3D 蛋白。首先，研究人员在体外评估了这两株 FAM3D 单克隆抗体的阻断效果。结果表明，这两株抗体均能有效抑制 Caco-2 细胞中 FAM3D 过表达所促进的 MTTP 表达，从而进一步强化了肠上皮细胞内 FAM3D 的自分泌通路。同时，由于 TNFα 处理显著促进了 HUVECs 中 FAM3D 的表达与分泌，研究人员利用 TNFα 处理后的 HUVECs 条件培养基成功诱导了 VSMC 的去分化；而向该条件培养基中添加 FAM3D 单克隆抗体则可明显逆转这一效应，这进一步证实了内皮细胞来源的 FAM3D 介导了 EC 促进的 VSMC 去分化过程。这些体外实验数据表明，单克隆抗体能够高效阻断 FAM3D 对肠上皮细胞和 VSMC 的生物学效应。

随后，研究人员评估了 FAM3D 单克隆抗体在体内对动脉粥样硬化的治疗效果(图 7 A)。结果表明，两种 FAM3D 单克隆抗体均能有效降低血浆中的总胆固醇和甘油三酯水平，尤其在极低密度脂蛋白/乳糜微粒组分中作用更为显著(图 7 B-E)，并进而抑制了高脂血症 Ldlr^−/− 小鼠的动脉粥样硬化进展(图 7 F and G)，与使用同型对照小鼠 IgG 治疗相比具有明显优势。此外，代谢笼实验显示，接受 FAM3D 单克隆抗体治疗的高脂血症 Ldlr^−/− 小鼠粪便中总胆固醇和甘油三酯的排泄量增加(图 7 H)。口服脂肪转运试验表明 FAM3D 单克隆抗体还能抑制肠道对甘油三酯的吸收(图 7 I)。同时，免疫印迹分析显示 FAM3D 单克隆抗体显著下调了高脂血症 Ldlr^−/− 小鼠空肠上皮细胞中 MTTP 的表达水平(图 7 J)。综上所述，这些结果共同表明，靶向 FAM3D 介导的 MTTP 上调及空肠脂质吸收的 FAM3D 单克隆抗体能够显著降低血液脂质水平，并有效抑制动脉粥样硬化。

fig.7

为确认 FAM3D 单克隆抗体是否直接阻断了 FAM3D 诱导的 VSMC 去分化，研究人员通过部分颈总动脉结扎的方式向 C57BL/6 小鼠施用了这些单克隆抗体。结果显示 FAM3D 单克隆抗体能有效抑制部分结扎颈总动脉中的新生内膜形成(图 7 K)，这表明 FAM3D 单克隆抗体可直接靶向 FAM3D 诱导的 VSMC 去分化过程。

此外，研究人员还检测了针对 FAM3D 的单克隆抗体在动脉粥样硬化模型和颈总动脉部分结扎模型中是否会引起潜在的安全问题。组织学分析以及血液生化指标和常规检查结果表明，两种 FAM3D 单克隆抗体的使用并未在动脉粥样硬化小鼠或颈总动脉部分结扎小鼠中引发明显的器官损伤或造血功能障碍。

综合来看 FAM3D 单克隆抗体 FAM3D 能够高效地靶向脂质依赖性和非脂质依赖性两种作用机制，从而有效缓解动脉粥样硬化，且安全性问题不显著。因此 FAM3D 是治疗动脉粥样硬化的一个极具潜力的治疗靶点。

本研究中所使用的Ldlr KO 小鼠由北京唯尚立德提供，该小鼠是在C57BL/6 的背景下通过 CRISPR/Cas 9 技术构建而成的。北京唯尚立德生物科技有限公司是拥有多年的基因编辑经验，已为数千名科研工作者及工业客户成功定制基因编辑模型，同时搭建了完善的基因工程动物创制平台、动物表型分析和实验技术服务平台、动物模型种源交流平台、实验动物繁育平台，欢迎您致电咨询。

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